EGFR BiTE1与T细胞在肿瘤治疗中的应用

上清转移和Transwell®实验 将滴定的EGFR BiTE1和泛T细胞（10:1）加入到96孔板中的NUGC4细胞中，孵育48小时。这些孔板的上清液直接转移或通过离心澄清后，转移到含有预先铺板5小时的SW620细胞的96孔板中。孔板进一步孵育48小时。作为对照，SW620细胞与T细胞和EGFR BiTE1共培养48小时。细胞毒性通过细胞成像核计数测定。为了确定哪种滤膜尺寸可以排除T细胞，使用HTS Transwell-961系统（Corning）设置了1 μm和5 μm的膜。单独的T细胞或T细胞与NUGC4细胞+EGFR BiTE1一起加入到上室，并孵育48小时。通过检测下室的CellTiter-Glo1（Promega）来测量T细胞通过膜的迁移。随后，将NUGC4细胞和T细胞±EGFR BiTE1加入到上室，将SW620细胞加入到下室，并孵育48小时。通过检测下室的CellTiter-Glo1来测量SW620细胞的细胞毒性。 ICAM-1和FAS间接免疫荧光 靶细胞以10,000个细胞/孔的密度铺板在Packard ViewPlate-96中，孵育18-24小时，有或无IFNγ和TNFα（Roche）或静息或BiTE1激活的T细胞。细胞用3.7%甲醛（ThermoFisher）固定，并用抗ICAM（Abcam）或抗FAS（ThermoFisher）和Hoechst核染料（ThermoFisher）染色。使用山羊抗小鼠Alexa Fluor1 488或647二抗（ThermoFisher）进行检测。未处理的细胞用于设定阳性百分比的荧光阈值。