JEDI T细胞杀伤试验与肿瘤诱导测量

体内 JEDI T 细胞杀伤试验 使用 A20 癌细胞进行了三细胞共培养细胞毒性试验，试验中包含 2.5×10^4 A20-GFP+ 细胞、2.5×10^4 A20-mCherry+ 细胞和 5×10^4 JEDI T 细胞（T:靶细胞比例为 2:1），除非另有说明，并在 24 或 48 小时后通过流式细胞术收获分析。对于涉及 WT、Fas−/− 和/或 B2m−/− 靶细胞系的五细胞共培养实验，T:靶细胞比例保持为 2:1，除非另有说明。使用 4T1 癌细胞的试验同样在 T:靶细胞比例为 25:1 的条件下进行。如需指示，在流式细胞术分析前，每份样本中均匀加入 Precision Counting Beads（BioLegend）的均质悬浮液。通过将感兴趣群体的事件计数除以同一样本中珠子的事件计数来计算标准化细胞计数。 Transwell 试验 三细胞和四细胞共培养细胞毒性试验按照上述方法进行，但指定的群体被接种到一个 24 孔板内的 Transwell 插入物中，该插入物由具有 1 微米孔径的可渗透膜分隔（Thermo Fisher Scientific）。48 小时后，将上室和下室的细胞混合，然后作为单一样本进行流式细胞术分析。 体外超抗原诱导的 T 细胞杀伤试验 从天真的 BALB/c 小鼠中使用 MagniSort Mouse CD4+ 或 CD8+ T 细胞富集试剂盒（Thermo Fisher Scientific）分离 CD4 和 CD8 T 细胞，按照制造商的协议进行。5×10^4 纯化的 T 细胞与 5×10^4 总 A20 细胞（包括所描述的基因型混合物）以及 50 ng/mL 金黄色葡萄球菌肠毒素 B（Toxin Technology）共培养 48 小时，之后收获用于流式细胞术分析。 肿瘤诱导和测量 将 3×10^6 总细胞在 100 μL 汉克平衡盐溶液（HBSS）中皮下注射到侧腹。对于双肿瘤模型，首次肿瘤注射后 10 天在对侧腹注射相同数量的总细胞，以延迟非应答肿瘤的致死性，从而在观察应答肿瘤的关键时间窗口内进行实验。通过卡尺测量在指定日期确定肿瘤大小（长度 × 宽度 × 高度）。