NETs 的生成：
- 使用 500 nM 的 PMA（每 30 ml 中性粒细胞溶液，浓度为 5 × 10^6/ml）刺激中性粒细胞，并在 150 × 25 mm 平底组织培养皿上（带有 20 mm 网格）于 37°C 和 5% CO2 条件下孵育 4 小时。这将促进 NETosis。24 孔板：每孔 2 × 10^6 细胞，0.4 ml 培养基。6 孔板：每孔 9 × 10^6 细胞，约 2 ml 培养基。
- 刺激 4 小时后，轻轻吸出并丢弃培养基，保留底部附着的 NETs 和中性粒细胞层。不要破坏这一层。
- 每个培养皿使用 15 ml 不含 Ca 和 Mg 的冷 PBS，通过在培养皿底部加入 15 ml PBS 进行洗涤，以使所有附着材料从底部脱落。
- 收集每个培养皿洗涤后的溶液，置于 15 ml 锥形管中，以 450 x g 的速度在 4°C 下离心 10 分钟。中性粒细胞和其他剩余细胞将沉淀在底部，留下无细胞的富含 NETs 的上清液。
- 将上清液分装到 1.5 ml 微离心管中，以 18,000 x g 的速度在 4°C 下离心 10 分钟。这将使所有 DNA 沉淀。 注：如果常规离心机可以达到如此高的转速，使用大试管进行离心会更简单且省时；否则，需要将上清液分装到小试管中，以便使用高速微离心机。
- 弃去上清液，将所有沉淀物重新悬浮在冰冷的 PBS 中，使其浓度达到每 100 μl PBS 中 2 × 10^7 中性粒细胞。这将产生可用于后续实验的无细胞 NET 贮存液。
- 使用分光光度法或其他 DNA 定量工具测量所得样品中的 DNA 浓度。样品中的合适浓度应在 140 - 180 ng/μl 之间。
