体内脱靶杀伤评估：Fas依赖的旁观者效应

为了评估体内脱靶杀伤情况，我们在缺乏内源性T细胞的Rag1−/−小鼠中接种了混合肿瘤，这些肿瘤由GFP(WT)细胞与mCherry(WT)或mCherry(Fas−/−)细胞组成，随后进行了GFP特异性T细胞的过继转移。尽管两组肿瘤中的Ag+靶细胞数量相同，但含有Fas−/−旁观者细胞的肿瘤对治疗的反应较弱（图2D，肿瘤体积最大减少50.6% vs. 71.2%；个体曲线见补充图S3D），并且复发更快，证实了Ag特异性T细胞能够在体内通过Fas依赖的方式清除旁观者肿瘤细胞。耗竭实验排除了自然杀伤细胞在这一现象中的作用（补充图S3E）。 接下来，我们使用双肿瘤模型来确定这种旁观者效应是系统性的还是需要局部存在Ag+细胞，正如我们在体外transwell实验中所观察到的那样。除了之前模型中使用的相同混合GFP+/mCherry+肿瘤（图2E，右侧），我们还在对侧接种了一个远处肿瘤（图2E，左侧），该肿瘤仅包含相应WT或Fas−/−基因型的mCherry+细胞。即使在主要肿瘤因GFP特异性T细胞转移而迅速缩小的情况下，这些Ag−远处肿瘤仍无消退，表明旁观者细胞毒性在地理上受到限制，并依赖于共定位的Ag−和Ag+肿瘤细胞（补充图S3F）。大范围成像显示，在这些远处肿瘤中，caspase-8介导的肿瘤细胞死亡明显减少（图2E，左侧；补充图S3G和S3H）。然而，来自同一小鼠的主要肿瘤的免疫荧光显示，转移的T细胞引起了广泛的活性caspase-8活性（图2E，右侧）。高倍镜下观察混合主要肿瘤确认了活性caspase-8与mCherry(WT)细胞的共定位（图2F），而mCherry(Fas−/−)细胞尽管被正在进行靶向杀伤的Ag+肿瘤细胞包围，却完全受到保护（图2G）。染色定量结果显示，在肿瘤刚开始消退的第6至8天，mCherry(WT)肿瘤细胞的凋亡数量是mCherry(Fas−/−)细胞的四倍多（图2H）。这一原位证据表明，mCherry+旁观者细胞的凋亡与T细胞转移后宏观肿瘤反应的Fas依赖性差异（图2D）相符并合理解释了这一现象。