靶向小鼠CD19的CAR-T细胞生成与体外杀伤试验

生成靶向小鼠CD19的CAR-T细胞 使用先前发表的抗小鼠CD19 CD3ζ-CD28 CAR构建体（43），通过逆转录病毒载体生成CAR-T细胞，具体方法如前所述（68），但进行了以下改进。简而言之，从BALB/c小鼠的脾脏和淋巴结中分离出白细胞。通过机械破碎和过滤过70纳米细胞筛网获得单细胞悬液。使用ACK缓冲液（Lonza）裂解红细胞，并使用MagniSort Mouse CD8+ T Cell Enrichment Kit（Thermo Fisher Scientific）根据制造商的协议负选择CD8+ T细胞。在6孔板中（每孔1.5×10^6个细胞）用5 μg/mL纯化的仓鼠抗小鼠CD3ε（克隆145-2C11，BD Biosciences）、1 μg/mL纯化的仓鼠抗小鼠CD28（克隆37.51，BD Biosciences）和20 ng/mL重组小鼠IL2（Gemini Bio-Products）激活细胞，培养基为含10% FBS、100 U/mL青霉素/链霉素/氨苄青霉素和50 μmol/L 2-巯基乙醇的RPMI。一天后，将1 mL/孔的病毒上清液（从−80°C冷冻库存中解冻）加入预先涂有15 μg/mL RetroNectin（Takara）的6孔板中，并在1 mL完全培养基（补充80 ng/mL IL2）中加入2×10^6个细胞。平板在30°C下以2,000 × g离心1小时后返回培养箱（第一次旋涡转染）。第二天，小心吸出1 mL培养基并替换为1 mL新的病毒上清液，再次在30°C下以2,000 × g离心1小时后返回培养箱（第二次旋涡转染）。然后，在含20 ng/mL IL2的培养基中维持细胞密度为1–2×10^6/mL，继续扩增4天后再进行冷冻保存。 体外小鼠CAR-T杀伤试验 将6×10^4个解冻的小鼠CAR-T细胞与1.5×10^4个[CD19+或CD19−]和[Fas+或Fas−] A20细胞共培养72小时，然后通过流式细胞术分析。在流式细胞术分析前，均匀地向每个样本中加入Precision Counting Beads（BioLegend）的均质悬浮液。通过将感兴趣群体的事件计数除以同一样本中微球的事件计数来计算标准化细胞计数，并通过计算与对照样本相比的计数减少百分比来计算标准化死亡率。