基于VHH的TCE设计：纳米抗体在ROR1特异性T细胞接合器中的应用

基于VHH的TCE设计 由于上述使用抗ROR1克隆2A2设计的TCEs显示出解耦能力但效力较低且细胞因子窗口较小，我们寻找新的ROR1结合剂。VHH（来自骆驼科动物的单域抗体，也称为纳米抗体）已被广泛描述为能够识别比传统抗体更广泛的表位（47）。这些VHH高度稳定，可用于构建多种格式的“即插即用”方式（48）。因此，我们专注于使用纳米抗体生成具有最佳解耦特性的ROR1特异性TCEs。为了获得与ROR1远端区域结合且距离细胞膜假设的最佳距离的VHH结合剂（基于我们对克隆2A2的结果），首先用全长ROR1蛋白免疫一只双峰骆驼，然后用仅包含ROR1的Ig样结构域的蛋白加强免疫。从噬菌体展示文库中鉴定出候选VHH。在筛选了大量VHH（数据未显示）后，我们鉴定出克隆5A1，其与人ROR1的Ig样结构域结合，表观亲和力约为20 nM（补充图S1），用于进一步研究。基于该VHH，设计了四种不同的T细胞接合器，每种由两个靶向ROR1的VHH和一个CD3结合Fab组成。为了避免引入多个变量来设计具有宽细胞因子窗口的TCE，(a) CD3结合剂IF3-3（对CD3ε的表观亲和力相对较高，约为10 nM，见补充图S2）和(b) 两个5A1 VHH之一的位置在铰链的N端直接与CD3结合Fab相对的位置保持不变。因此，这些构建体仅在第二个VHH结合模块的位置上有所不同。