ICAM-1和FAS阻断试验技术详解

阻断试验 对于ICAM-1和FAS试验，SW620细胞以每孔10,000个细胞接种在黑色Packard ViewPlate-96板中，并用10 ng/ml IFNγ和5 ng/ml TNFα处理。18-24小时后，去除培养基，并向孔中加入2倍浓度的抗ICAM-1（克隆84H10，Beckman Coulter）、抗FAS（克隆ZB4，Enzo）或小鼠IgG1对照抗体（Abcam）。然后将平板在37°C下孵育60分钟，随后加入静息或BiTE1激活的T细胞（效应细胞与靶细胞比为10:1），继续孵育24小时。FAS激活抗体（克隆CH11，Millipore）用作FAS激活的对照。对于IFNγR1和TNFRSF1A阻断试验，SW620细胞按上述方法处理，但不进行细胞因子预处理。抗IFNγR1（克隆GIR208和92101，R&D Systems）和抗TNFRSF1A（克隆16803，R&D Systems）用作中和抗体。 荧光素酶（LUC）标记 亲本SW620和MOLM-13细胞用含有huEF1-α启动子驱动的萤火虫荧光素酶表达的慢病毒在MOI为5的条件下转导。该载体携带嘌呤霉素抗性基因，转导后通过嘌呤霉素选择。经过3-4周的细胞传代后，通过p24 ELISA检测确认RCL（复制型慢病毒）阴性。