CRISPR文库设计与筛选：基于A20淋巴瘤细胞的基因靶向研究

文库设计 291个靶基因用于筛选，这些基因是通过手动策划并选择出来的，基于在A20淋巴瘤细胞（登录号ENCSR000CLV）中表达水平>1 RPKM，并与UniProt知识库（64）交叉比对，注释为分泌型、膜蛋白、免疫相关、炎症反应或细胞因子。sgRNA序列来自先前描述的CRISPR文库（65），并列于补充表S1。为了提高灵敏度，靶基因被分成四个独立的池进行筛选。 文库制备和慢病毒生产 定制的寡核苷酸文库在水中复溶至最终浓度为0.01 pmol/μL，并使用Q5 Hot Start聚合酶（New England Biolabs）进行PCR扩增。每个PCR扩增后的文库随后使用PCR纯化试剂盒（Qiagen）按照制造商的说明进行纯化。随后，使用BbsI限制性内切酶（New England Biolabs）在37°C下过夜进行限制性酶切。酶切后的文库通过在1× TBE运行缓冲液中的2%琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用凝胶提取试剂盒（Qiagen）按照制造商的说明回收。文库寡核苷酸克隆到含有下游人类磷酸甘油酸激酶启动子的NGFR转基因的慢病毒载体中，位于人类U6启动子的下游。载体骨架用AgeI和EcoRI消化，用FastAP热敏感碱性磷酸酶（Thermo Scientific）处理，并在1%琼脂糖凝胶上纯化，使用凝胶提取试剂盒（Qiagen）按照制造商的说明回收。连接反应使用Quick Ligase Kit（New England Biolabs）进行。为了防止文库多样性丢失，转化NEB 10-beta电感受态细胞（New England Biolabs）后，从十五个10厘米的平板上收集菌落。质粒池使用无内毒素的Maxi prep试剂盒（Qiagen）准备用于转染。慢病毒载体的生产如前所述（34）。简而言之，在Ca3PO4转染前24小时接种293T细胞，使用第三代VSV假型包装质粒和文库转移质粒。收集上清液，通过0.22-μm滤器过滤，并通过超离心纯化。病毒滴度通过293T细胞的极限稀释法估计。 筛选试验 为了确保大多数转导细胞只接受一个载体并且文库有适当的代表性，每重复实验使用1e6个细胞在MOI为10的条件下进行转导，以确保约10%的转导效率。转导在12孔板中进行，总体积为500 μL，含有5 μg/mL聚凝胺（Millipore）。每种细胞类型（A20-Cas9-GFP和A20-Cas9-mCherry）和每个文库进行了五次单独的转导，以生成重复样本。转导一周后，通过流式分选纯化接收并整合载体的细胞，选择NGFR+细胞。纯化的细胞在培养中扩增五天，然后冷冻保存，并在筛选试验前两天解冻。 每孔在96孔U形底板中共培养2 × 10^4个A20-GFP-文库+细胞、20,000个A20-mCherry-文库+细胞和40,000个预激活的JEDI T细胞（来自三只小鼠）。每种条件进行96次单独反应（1块板），并合并以确保文库的适当代表性。每个重复包括一块加入JEDI T细胞的板和一块未加入T细胞的对照板。两天后，将各孔合并并通过FACS纯化活的NGFR+GFP+细胞和NGFR+mCherry+细胞。纯化的细胞在培养中再扩增两天，然后冷冻保存，用于未来的迭代和保存冷冻的细胞团（2e6细胞）以提取DNA。