流式细胞术与分选技术详解

流式细胞术和分选 活力染色在HBSS中使用固定活力染料450或780（BD Biosciences）以1:1,000的比例在室温下进行5分钟。小鼠白细胞的表面染色在自制的FACS封闭缓冲液中使用单克隆抗体进行，这些抗体包括：B220（RA3-6B2；BioLegend）、CD8（53-6.7；BioLegend）、CD4（RM4-5；BioLegend）、CD19（6D5；BioLegend）、CD45.1（A20；BioLegend）、CD45.2（104；BioLegend）、CD95（SA367H8；BioLegend）、CD107a（1D4B；BioLegend）、H-2Kd（SF1-1.1；BioLegend）、H-2Kd-HYLSTQSAL四聚体（NIH四聚体核心设施）、PD-L1（10F.9G2；BioLegend）、NGFR（C40-1457；BD Biosciences）和TCRb（H57-597；BioLegend）。人白细胞的表面染色在自制的FACS封闭缓冲液中使用单克隆抗体进行，这些抗体包括：CD3（HIT3a；BD Biosciences）、CD4（RPA-T4；BD Biosciences）、CD8（RPA-T8；BD Biosciences）、CD19（HIB19；BioLegend）、CD20（2H7；BioLegend）和CD95（DX2；BioLegend）。所有表面抗体均以1:400的比例稀释，样品在黑暗中室温孵育15分钟。根据制造商的协议，加入Hoechst 33258（BD Biosciences）、固定活力染料（BD Biosciences）、Annexin V（BioLegend）和/或7-AAD（BioLegend）来分析死细胞。对于胞内染色，表面染色的细胞使用商业缓冲液套装（Invitrogen）固定和透化，然后与抗切割caspase-3（C92-605.1；BD Biosciences）、抗颗粒酶B（NGZB；Thermo Fisher Scientific）或抗IFNγ（XMG1.2；BioLegend）以1:200的比例稀释，在30分钟内进行染色。样品使用LSRFortessa（BD Biosciences）或Attune（Thermo Fisher Scientific）获取，数据使用Cytobank进行分析。细胞分选在FACSAria（BD Biosciences）上进行。