GFP特异性体内肿瘤模型与免疫荧光分析

GFP 特异性体内肿瘤模型 BALB/c(Rag1−/−) 小鼠在右侧皮下接种同质 A20-GFP（野生型或 Fas−/−）肿瘤，并在指定日期通过尾静脉注射 5 × 10^3 个 GFP 特异性 T 细胞。对于接种混合异质肿瘤或双肿瘤模型的 BALB/c(Rag1−/−) 小鼠，在指定日期通过尾静脉注射 3 × 10^5 个 GFP 特异性 T 细胞。在某些情况下，通过在 T 细胞转移前 6 天和 2 天分别给予两次腹腔注射 50 μL 抗去唾液酸 GM1（Wako），以及此后每 4 天给予 25 μL 剂量来耗竭自然杀伤细胞。所有用于免疫荧光分析的肿瘤均在 T 细胞转移后第 8 天解剖取出。 免疫荧光 整个肿瘤被解剖取出，用 PBS 洗涤，并在过碘酸盐-赖氨酸-甲醛缓冲液（0.05 M 磷酸盐缓冲液，含 0.1 M L-赖氨酸 [pH 7.4]、2 mg/mL NaIO4 和 10 mg/mL 甲醛）中于 4°C 孵育过夜。组织依次在 10%、20% 和 30% 蔗糖溶液中平衡 2 小时，然后包埋在 OCT（Thermo Fisher Scientific）中并迅速在干冰上冷冻，储存于 -80°C。使用冷冻切片机制备的 10-μm 切片在封闭缓冲液（2% FBS 和 1% BSA 在 PBS 中）中孵育 2 小时，随后在 0.1× 封闭缓冲液中与大鼠抗 GFP（FM264G，AlexaFluor 488；BioLegend）、鸡抗 mCherry（ab205402；Abcam）、大鼠抗 CD8（53-6.7，AlexaFluor 647；BioLegend）、兔抗裂解的 caspase 8（多克隆；Novus Biologicals）和/或大鼠抗 B220（RA3-6B2，BV421；BioLegend）孵育过夜。切片用 PBS-Tween（0.1%）洗涤，并在指定的情况下与驴抗兔（Poly4064，AlexaFluor 594 或 647；BioLegend）和/或山羊抗鸡（A32759，AlexaFluor 594；Thermo Fisher Scientific）二抗孵育 1 小时。使用 ProLong Gold 抗褪色剂（Thermo Fisher Scientific）作为封片剂，并在蔡司 LSM780 共聚焦显微镜上获取 16 位图像。图像使用 FIJI（67）进行分析。为了定量分析，计算每个通道前 10% 像素的平均强度，以标准化尺度去除背景信号。对于像素共定位分析，在使用 Image Calculator 功能对从每个通道创建的二值图像执行逻辑运算之前，应用了 Otsu 和 RenyiEntropy 自动阈值算法。分析包括来自三组独立实验的 3 至 4 只小鼠的至少 22 至 30 个视野。