测序和筛选分析
文库制备方法参考了先前的描述（66）。简而言之，使用DNeasy Blood and Tissue Kit（Qiagen）提取基因组DNA。sgRNA序列位点从基因组DNA中扩增，具体步骤如下：在50-μL反应体系中，加入25 μL Q5 High-Fidelity 2X Master Mix（NEB），2.5 μL正向引物（5 μmol/L），2.5 μL反向引物（5 μmol/L），以及200 ng样本中的引导DNA。循环参数为：98°C预变性30秒，随后28个循环（98°C变性10秒，61°C退火30秒，72°C延伸25秒），最后72°C延伸2分钟。用于扩增目标位点的引物包含直接与Illumina流动池杂交的序列。条形码插入在Illumina测序引物结合位点的下游，以便进行多重测序。PCR扩增的文库通过2%琼脂糖凝胶纯化250-bp片段，使用凝胶提取试剂盒（Qiagen）。测序前，所有纯化的文库扩增产物均在Agilent 2100 Bioanalyzer上进行分析。制备好的文库进行多重测序，并在Illumina Hi-Seq2000上进行测序。
去条形码的原始读取计数被归一化到每个样本中的总映射读取数。对于每个条件，GFP+群体中五个独立重复的中位数与配对的mCherry+群体进行了对比。对所有5,186个数据点进行了线性回归，并计算了每个目标在GFP+群体中观察到的读取百分比相对于预期读取的标准化残差（Z分数），以确定富集的显著性。
JEDI T细胞的体外和体内使用准备
解剖JEDI小鼠的脾脏和淋巴结，通过机械破碎和过滤过70-μm细胞筛获得单细胞悬液。使用ACK缓冲液（Lonza）裂解红细胞，并使用MagniSort Mouse CD8+ T Cell Enrichment Kit（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的说明负选择CD8+ T细胞。文中描述的使用JEDI细胞的体外实验中，细胞用5 μg/mL板结合纯化的仓鼠抗小鼠CD3ε（克隆145-2C11；BD Biosciences），1 μg/mL纯化的仓鼠抗小鼠CD28（克隆37.51；BD Biosciences），以及20 ng/mL重组小鼠IL2（Gemini Bio-Products）在含10% FBS、100 U/mL青霉素/链霉素/氨苄西林和50 μmol/L 2-巯基乙醇的RPMI培养基中激活两天。文中描述的使用GFP特异性T细胞的体外实验中，细胞首先使用NIH四聚体核心设施生产的H-2Kd-HYLSTQSAL四聚体试剂通过FACS纯化，然后按上述方法激活。所有体内实验均使用新分离的四聚体分选的GFP特异性T细胞，未进行激活。
