线粒体蛋白互作验证：共免疫沉淀与SPR技术方案如何选择？

为了弥补全长、天然状态结合证据的缺失： 选项 1 进行线粒体内膜限制的共免疫沉淀（co-IP）并使用原位交联。分离线粒体，应用蛋白酶保护以去除线粒体外蛋白质，对完整的线粒体内膜进行交联（例如，DSP 0.5 mM，30分钟，4°C），用去垢剂（0.5% digitonin）溶解，并免疫沉淀OGDH；Western印迹检测Par3。包括IgG IP、shOGDH和Par3-Q1301D/P1323T对照。同时，使用在相似水平表达的Par3-MTS与Par3-MTS(Q1301D/P1323T)定量共免疫沉淀信号的损失。 选项 2 在体外重建全长Par3-OGDHc的结合，并通过表面等离子共振（SPR）或生物层干涉测量法（BLI）定量其亲和力/动力学。纯化全长人源Par3和天然OGDHc，测定野生型与界面突变体的Kd值及结合/解离速率。结合使用DSSO对完整线粒体进行交联质谱分析，以绘制验证天然复合物中界面的蛋白质间交联图谱。