CAR-T细胞体内外杀伤试验研究

体内小鼠CAR-T杀伤试验 BALB/c小鼠在接受5 Gy全身照射（TBI）后立即接种均质（100% A20 CD19+细胞）或异质（95% A20 CD19+/5% A20 CD19−细胞）肿瘤。在TBI后的第四天，通过尾静脉注射2.5×10^6个CAR-T细胞进行过继转移。为了阻断FasL，从过继T细胞转移当天开始，每隔三天腹腔注射250 μg/小鼠的InVivoMab抗小鼠FasL（MFL3，Bio X Cell），但首次加载剂量为500 μg/小鼠。小鼠每天监测生存情况，并密切观察是否有系统性疾病（如腿麻痹）的迹象，如有则予以安乐死。 体外人CAR-T杀伤试验 人CAR-T细胞产品按先前描述的方法（44）制造并冷冻保存。1×10^6个解冻的CAR-T细胞与5×10^4个CD19+/+FAS+/+、CD19−/−FAS+/+、CD19+/+FAS−/−和CD19−/−FAS−/− Raji细胞共培养6小时（除非另有说明），然后通过流式细胞术分析。所有Raji细胞均用CellTrace CFSE（Thermo Fisher Scientific）标记，所有CD19+/+ Raji细胞还用CellTrace Violet（Thermo Fisher Scientific）标记，具体操作按照制造商的说明书进行，用于分选目的。 使用原代CLL细胞的体外杀伤试验 收集患者PBMC并冷冻保存。2×10^5个解冻的患者细胞与8×10^5个人CAR-T细胞或8×10^5个健康供者CD8 T细胞在1 nmol/L blinatumomab存在下共培养两天，然后通过流式细胞术分析。患者细胞在接种前用CellTrace Violet（Thermo Fisher Scientific）标记，具体操作按照制造商的说明书进行，用于分选目的。分析时仅使用CD20+细胞来评估对恶性细胞的影响。