PD-1、TIGIT 和 CD69 在 T 细胞上的检测方法

PD-1、TIGIT 和 CD69 在 T 细胞上的检测 在设置细胞毒活性实验后，将靶细胞加入 96 孔板的孔中（每孔 5,000 个靶细胞），并在 37°C 下孵育 5 小时。5 小时孵育后，小心移除孔板中的细胞培养基而不扰动靶细胞，并向含有靶细胞的孔中加入 50 μL 新鲜的 PBMCs（每孔 150,000 个 PBMCs）（效应细胞与靶细胞比为 30:1）。然后向指定孔中加入 50 μL 的 CD3xROR1 TCEs，其中含有 150,000 个 PBMCs 和 5,000 个靶细胞。在 37°C 下孵育 24、48 或 72 小时后，收集 PBMCs 并用 PBS 离心洗涤一次（500 ×g，室温下 5 分钟），然后将其转移到 V 底 96 孔板中。 为了制备活/死固定红色染料，将一管粉末溶解于 50 μL 的 DMSO 中制成储备液，然后将 1 μL 储备液稀释到 1 mL 的 PBS 中以制备工作液。将 100 μL 的活/死固定红色工作液加入 V 底 96 孔板中的细胞中，在室温下孵育 15 分钟。15 分钟孵育后，用 PBS 离心洗涤两次（500 g，室温下 5 分钟）。然后将细胞与抗体（PE-Cy5 标记的小鼠抗人 TCRα/β 抗体、PE 标记的小鼠抗人 CD19 抗体、BB515 标记的小鼠抗人 CD56 抗体、BB700 标记的小鼠抗人 CD14 抗体、PE-Cy7 标记的小鼠抗人 PD-1、TIGIT 或 CD69 抗体）在 100 μL 的 BioLegend 染色缓冲液中于 4°C 下孵育 45 分钟。45 分钟孵育后，用 PBS 离心洗涤细胞（500 g，室温下 5 分钟），并重悬于 100 μL 的 BioLegend 固定缓冲液中。样品随后在 Cytek 流式细胞仪上分析。数据使用 FlowJo 软件分析，门控策略如下：简而言之，通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）对靶细胞群体进行门控。从靶细胞群体中通过 FSC-A 和 FSC-H 选择单细胞。通过低活/死红色染料对单细胞中的活细胞进行门控。从活单细胞中通过 TCRα/β 高表达对 T 细胞进行门控。最后，通过 PD-1、TIGIT 或 CD69 高表达对 T 细胞上的 PD-1、TIGIT 和 CD69 表达进行门控。